Wako石蠟切片骨相關酶（TRAP，ALP）雙重染色產品推介

       檢測相關細胞的生理活性是掌握生物體骨代謝狀態的有效方法。骨組織使用堿性磷酸酶（ALP）進行染色可明確成骨細胞的成骨潛能，使用抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色可明確破骨細胞的骨吸收能力。并且在同一切片上進行二重染色時，可同時識別二者

       正常的骨代謝是通過成骨細胞生長與破骨細胞建立骨吸收而維持平衡。成骨細胞的標記酶是堿性磷酸酶（ALP）。破骨細胞的標記酶是抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）。這兩種標記酶在組織切片或者培養細胞過程中，被作為成骨細胞、破骨細胞存在的標記指標。

       TRAP/ALP破骨成骨雙重染色試劑盒可通過骨組織切片以及培養細胞中TRAP/ALP酶活性進行組織染色。通過觀察成骨細胞和破骨細胞的染色成像，可檢查細胞的分化狀態和骨組織的分布情況。

一、特點：

使用時混合3種溶液，可制備TRAP酶活性染色的顯色底物溶液。

ALP酶活性染色使用的是預混物溶液，操作簡便。

TRAP的活性部位呈紅紫色，ALP的活性部位呈藍色（茶褐色），可雙重染色。適用于骨組織切片（脫鈣GMA樹脂包埋切片）以及培養細胞。

二、染色方法

染色法是Lorch的Gomori法。使用的是偶氮染料法和耦合法結合的TRAP/ALP染色試劑盒。Lorch推薦切片厚度為8μm，同時也研究了普通的4μm切片是否能染色、雙重染色的順序應該先染TRAP和ALP中的哪一個、封片劑是否必須選水溶性封片劑等問題。

染色法結果：偶氮染料法中切片過厚導致酶擴散圖像。即用TRAP染色骨質有紅染傾向，但即使是4μm厚度，只要增強反應條件（反應溫度和反應時間），也能充分染色的。換言之，TRAP染色中反應溫度從室溫調至37℃，反應時間從30分鐘調至45分鐘或60分鐘。ALP染色在37℃反應45分鐘至3小時，或者室溫（10-15℃）下反應時間增加至一晚。此結果顯示，兩者色調平衡，染色效果好。但是，反應條件的增強導致ALP染色切片產生了很多色素顆粒。另外，TRAP和ALP的染色順序哪一個先染色都是可以的。如果先進行ALP染色時，在TRAP陽性部位呈明顯的紅色，鮮艷處為破骨細胞。獲得比較好的標本。但是，ALP的反應產物經過TRAP溶液處理后，會產生白色混濁顆粒，沉淀在組織上。因此，先TRAP染色，接著ALP染色的方法是可行的。封裝法是利用甲基綠數秒間核染色處理。水洗后，37℃下干燥，二甲苯浸透，用馬里醇(Marinol)永jiu封存。

脫鈣石蠟包埋切片的TRAP/ALP雙重染色

用1年齡小鼠腰椎的EDTA脫鈣石蠟切片，進行TRAP/ALP雙重染色。

TRAP陽性將破骨細胞染成紅色，ALP陽性將細胞活性強的細胞（成骨細胞軟骨細胞）染成褐色。（上：弱擴大，下：強擴大）

TRAP和ALP的雙酶染色實驗中通過對固定、脫鈣、染色進行多處改良，實現了對脫鈣石蠟標本的染色。但是酶擴散圖像對TRAP染色的效果ji佳。出于各種原因的考慮，關于固定步驟的影響，如果固定不充分的話，容易抑制脫鈣水平。進而導致酶擴散的發生。另外，注意脫鈣本身的影響也是有必要的。總而言之，和非脫鈣標本相比較，脫鈣標本的擴散圖像更加明顯。脫鈣會使酶擴散變強。

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