WB實驗中單層貼壁總蛋白的提取方法

一、前言

蛋白質印跡法（Western Blot）通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的細胞或生物組織樣品進行著色，通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質在所分析的細胞或組織中表達情況的分子生物學技術。Western Blotting實驗單層貼壁細胞總蛋白的提取步驟：

二、操作步驟

1. 1. 倒掉培養(yǎng)液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液（或將瓶直立放置一會兒使殘余培養(yǎng)液流到瓶底然后再用移液器將其吸走）。

2. 2. 每瓶細胞加3ml 4℃預冷的PBS（0.01M pH=7.2～7.3）。平放輕輕搖動1min洗滌細胞，然后棄去洗液。重復以上操作兩次，共洗細胞三次以洗去培養(yǎng)液。將PBS棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上。

3. 3. 按1ml裂解液加10μl PMSF（100mM），搖勻置于冰上。（PMSF要搖勻至無結晶時才可與裂解液混合。）

4. 4. 每瓶細胞加400μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，為使細胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來回搖動。

5. 5. 裂解完后，用干凈的刮棒將細胞刮于培養(yǎng)瓶的一側（動作要快），然后用槍將細胞碎片和裂解液移至1.5ml離心管中。（整個操作盡量在冰上進行。）

6. 6. 于4℃下12000 rpm離心5min。（提前開離心機預冷）

7. 7. 將離心后的上清分裝到0.5min的離心管中放于-20℃保存。

8. 以上步驟可簡單概述為：收集細胞、裂解細胞、離心取上清、保存。

三、PBS推薦

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