ROS的檢測方法

ROS在細胞生命，應激和死亡中具介導作用，今天讓我們來聊下ROS吧~

一、ROS簡介

活性氧（reactive oxygen species，ROS）廣泛指代氧來源的自由基和非自由基，包含了超氧陰離子（O2-）、*（H2O2）、羥自由基（OH-）、臭氧（O3）和單線態氧（1O2），由于它們含有不成對的電子，因而具有很高的化學反應活性。

在機體內，ROS的主要來源之一是線粒體內膜的呼吸鏈底物端，在線粒體中的電子傳遞鏈復合物將電子傳遞給O2的過程中，有一部分O2被還原，形成O2-或H2O2。其中，最為重要的是O2-，它是大部分的ROS的前體，主要由線粒體內膜呼吸鏈中的蛋白酶復合體Ⅰ、Ⅲ產生。這部分作為代謝副產物的ROS長期被當作損傷生物大分子的毒性分子，但近年來被認為在較低水平時作為一類信號小分子具有生理作用，另一個ROS的重要來源是NADPH化酶，其催化亞基被稱為NADPH氧化酶2（NADPHoxidase2，NOX2/gp91phax），能夠在細胞質膜上表達。在不同的組織中已經鑒定了6種NOX-2的同瀝物：NOX1，NOX3，NOX4，NOX5，DUOX1和DUOX2，統稱為NOX家族蛋白。這些酶能通過質傳遞電子產生ROS，可以大量存在于吞噬細胞，也在其他各種組織細胞中以較低水平普遍存在，參與很多膜受體下游信號激活。

ROS保護細胞免受病原體的侵害，但較高濃度的ROS會誘發許多疾病，例如惡性腫瘤，糖尿病，關節炎，動脈粥樣硬化，心臟病并增強衰老過程。

二、檢測方法

目前有多種方法用于檢測ROS，包括熒光染色法、電子順磁共振技術（EPR）、化學發光法、色譜法、分光光度法、電化學生物傳感器以及基于熒光蛋白等七種。在這里，我們將著重介紹熒光染色法，以及其在檢測細胞內ROS時的原理和操作步驟。

檢測原理

目前，用于檢測細胞內ROSzuiguang泛采用的方法是DCFH-DA熒光探針法。DCFH-DA（二氯熒光黃雙乙酸鹽）是一種可指示的探針，其本身不具有熒光，但可以自由穿過細胞膜。一旦進入細胞，它會被細胞內的酯酶水解成DCFH。由于DCFH無法穿過細胞膜，因此熒光探針會在細胞內積聚。細胞內的ROS能夠氧化無熒光的DCFH，生成有熒光的DCF，且熒光強度與ROS水平成正比。通過熒光顯微鏡、流式細胞儀或激光共聚焦顯微鏡等設備，在最大激發波長480nm和最大發射波長525nm下檢測熒光信號。

檢測步驟：

1.裝載探針

1）先用無血清培養基稀釋陽性對照（Rosup,100mM）到常用工作濃度100μM，對于刺激時間較短的細胞，先裝載探針，后用活性氧陽性對照（Rosup）或自己感興趣的藥物刺激細胞。

2）對于刺激時間較長的細胞，先用活性氧陽性對照（Rosup）或自己感興趣的藥物刺激細胞，后裝載探針。

1.1原位裝載探針（本方法僅適用于貼壁細胞）

1）細胞準備：檢測前一天進行細胞鋪板，確保檢測時細胞密度達到50~70%。

2）誘導：去除細胞培養液，加入適量經合適的緩沖液或無血清培養基稀釋到工作濃度的藥物，于37℃細胞培養箱內避光孵育，具體誘導時間根據誘導物本身特性，以及細胞類型來決定。

3）探針裝載：按照1:1000用無血清培養基稀釋DCFH-DA，使終濃度為10μM。吸去誘導用藥物，加入適當體積稀釋好的DCFH-DA工作液，以覆蓋住細胞為宜。

4）細胞清洗：用無血清培養基洗滌細胞1~2次，以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。

1.2收集細胞后裝載探針（適用于貼壁細胞和懸浮細胞）

1）細胞準備：按照標準方法培養細胞，必須保證檢測所用細胞狀態健康。按照適當方法，清洗并收集足量的細胞。

2）誘導：將收集好的細胞懸浮于適量稀釋好的藥物，于37℃細胞培養箱內避光孵育，具體誘導時間根據誘導物本身特性，以及細胞類型來決定。

3）探針裝載：離心去除上清，收集細胞，加入濃度為10μM的DCFH-DA探針，以覆蓋住細胞為宜。

4）細胞清洗：用無血清細胞培養基洗滌細胞1~2次，以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。
2.檢測

1）原位裝載探針法：激光共聚焦顯微鏡直接觀察，或收集細胞后用熒光分光光度計、熒光酶標儀或流式細胞儀檢測。

2）收集細胞后裝載探針：用熒光分光光度計、熒光酶標儀或流式細胞儀檢測，也可以用激光共聚焦顯微鏡直接觀察。