小分子蛋白的WB該如何？

WB（WesternBlot）是一種常用的生物化學實驗技術，用于檢測和分析蛋白樣品中特定蛋白質的存在和表達水平。它通過將樣品中的蛋白質分離并轉移到膜上，然后使用特定的抗體識別目標蛋白，并通過化學或免疫檢測方法來可視化這些蛋白質。WesternBlot技術通常包括樣品制備、SDS-PAGE電泳分離、蛋白轉印、封閉和抗體檢測、曝光顯影等步驟。目前WB被廣泛應用于生物醫學研究中，用于研究蛋白質表達、翻譯后修飾以及蛋白質相互作用等。

圖1.WB流程圖

在日常實驗過程中，小分子蛋白是非常常見的，小分子蛋白是指待檢測的蛋白分子量小于20kda，常見的凋亡蛋白如Bcl2、Caspase-3、Bax，自噬相關蛋白如LC3B等均為小分子蛋白，這類蛋白由于較小的分子量，易受到凝膠網孔的影響在電泳過程中彌散，導致難以分離和檢測。因此，為了檢測到小分子量的蛋白，需要對實驗步驟進行一些優化，以提高實驗成功率。

1. 配膠：整體配膠遵循蛋白分子量越小膠濃度越大的原則，對于小分子蛋白來說，分離膠濃度一般為12%-15%，對于小分子蛋白條帶可以分的更加清晰。同時在倒膠時濃縮膠的比例可以適當增加到4：6，使其充分濃縮，后續電泳過程中一定程度上可以減少彌散。15-20kda可選擇12%的凝膠；10-15kda可選擇13.5%的凝膠；小于10kda的蛋白用15%的凝膠或者用Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳體系。與傳統的Gly-SDS-PAGE相比，Tricine-SDS-PAGE使用三羥甲基氨基甘氨酸（Tricine）代替甘氨酸（Gly），具有更好的小分子蛋白分離效果。

2. 上樣：根據日常上樣經驗，建議在跑小分子蛋白時增加1倍上樣量，防止蛋白彌散過多。選擇marker時，選擇適用于小分子蛋白的marker，后續敷抗體時可以更清楚的進行裁膜。電泳開始前可用1′loadingbuffer補齊未點樣的膠孔，防止兩邊不齊跑成“八"字。

圖1：賽默飛marker示意圖（左：常規蛋白marker；右：小分子蛋白marker）

3. 電泳：濃縮膠部分設置恒壓70V、30min左右，一般即可濃縮到一條線上之后調大電壓至110V，至所需蛋白區域全部分開為止。盡量避免長時間低電壓跑膠，易導致蛋白彌散過多。同時整個電泳過程中注意降溫。

4. 轉膜：由于小分子蛋白分子量小，吸附能力弱，因此轉膜時選擇0.22μm的PVDF膜，常規0.45μm膜容易穿透，剩余條件同正常蛋白一般可以滿足條件。

5. 封閉：快速封閉液或脫脂牛奶按正常條件封閉即可。裁膜時根據marker上下留出足夠多的空間。

6. 一抗孵育：在保證上述條件的基礎上，一抗是出好結果的關鍵一步，若沒前期實驗經驗，一抗的稀釋比一般按照說明書配置，若有前期實驗的經驗，可適當進行比例調整，一抗濃度過高最后顯影階段易出現雜帶，過低則可能看不到條帶。使用1′TBST緩沖液稀釋，4℃孵育過夜。

7. 后續二抗比例及孵育時間、顯影按常規操作即可。需要注意若抗體不好用或者蛋白難出結果，在敷完一二抗時可適當延長洗膜時間及次數。

注意事項：

1. 轉膜時，若蛋白分子量過小，可適當提高甲醇比例（30%左右）改善吸附能力。

2. 跑小分子蛋白時marker盡量不跑到一張膜上，對于常見內參GAPDH、Actin及Tubulin等來說，分離膠濃度大上述蛋白區域一般分不開或分離不完整，易導致內參不齊。

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