內切酶實驗的注意事項有哪些？

你知道內切酶實驗的注意事項有哪些嗎？讓我們一起來看看吧！

一、限制性內切酶一般反應條件

當進行限制性酶切反應時，為確保最佳的反應條件，務必要遵守限制性內切酶供應商提供的建議。在此過程中需要考慮的重要參數包括：底物 (DNA) 和酶的量、反應體積以及孵育時間。

根據傳統的定義，在最佳反應條件下，一個單位的限制性內切酶可以在1小時內，在50μL體系中 wan全酶切1μL 定義底物（例如，質粒 pUC19）。盡管單位定義提供了一種測定方式，但還需注意，根據 DNA 底物之中的識別序列出現的頻率及所用底物類型，針對不同DNA底物使用等量的限制性內切酶可能需要不同的最佳反應條件。實際上，酶供應商往往根據 DNA 樣本的潛在質量、數量和性質波動，推薦比wan全酶切所需量多5至20倍的酶（或1μL 酶/反應體積）。

二、星號活性

星號或“松弛"活性是限制性內切酶的一種固有性質，即在非最you反應條件下，限制性內切酶可能會作用于與其天然識別位點存在細微差異的識別序列。例如，如下圖所示，EcoRI 可以識別和切割位點5’-GAATTC-3’，但其星號活性可能導致序列在5’-TAATTC-3’和5’-CAATTC-3’處被切割。同樣，BamHI 除了可切割其正常的識別序列 5’-GGATCC-3’ 外，還可切割 5’-NGATCC-3’、5’-GPuATCC-3’和 5’-GGNTCC-3’（其中 N 代表任意核苷酸）。

需特別指出，在最佳反應條件下，“星號"位點的切割率要遠遠低于正常的識別位點（大約相差 105–106）。因此，酶切期間出現星號活性的常見原因為限制性內切酶過量和/或孵育時間過長（過度酶切）。此外，高濃度甘油（例如，>5%）、低濃度鹽、非最佳 pH、存在有機溶劑，以及除 Mg2+ 之外的二價陽離子都可能造成底物 DNA 的非特異性切割。使用酶制造商推薦的實驗方案和緩沖液，可避免出現星號活性。

三、不wan全酶切

不wan全酶切是在限制性內切酶使用過程中常遇到的問題之一。當酶量過多或過少時，都可能發生不wan全酶切。DNA 樣本中存在污染物也可能導致不wan全酶切。緩沖液組分、孵育時間和反應溫度等欠佳的反應條件是不wan全酶切的常見原因。

部分限制性內切酶需要輔因子才能實現wan全活性。例如，Esp3I (BsmBI) 需要 DTT，而 Eco57I (AcuI) 需要 S-腺苷甲硫胺酸。AarI 和 BveI (BspMI) 等部分限制性內切酶需要兩個拷貝的識別位點才能實現有效切割；針對這一類酶，通常向反應物之中添加一份帶有識別位點的寡核苷酸來增強酶活性。

除了反應條件和酶性質外，DNA 自身的性質也會影響限制性酶切。甲基化的 DNA 可耐受部分限制性內切酶的切割（詳見甲基化部分）。酶的識別位點過于接近終端（線性底物 DNA 中）以及切割位點相鄰（雙酶切）都可能影響酶切割 DNA 的效率）。此外，部分超螺旋 DNA 分子要比線性 DNA 分子更難切割，增加 5-10 倍的酶量可有助實現wan全酶切。

四、酶切圖譜不正常

即便遵守了制造商的使用說明，仍可能觀察到預料之外的底物 DNA 切割結果。為避免陷入此類困境，必須確保酶和 DNA、反應所用的試劑均不含污染物（例如，其它限制性內切酶、DNA 和核酸酶）。

出現預料之外切割的一個原因是，在增殖和擴增過程中，底物 DNA 引入了突變。突變可能破壞已知的識別位點或創造出新的識別位點，從而產生預料之外的酶切結果。對 DNA 進行Sanger 測序，是一種判斷突變是否引起底物 DNA 出現預期外切割的有效方法。

有時候預期之外的酶切圖譜是由檢測過程而非酶切過程造成的。部分限制性內切酶（例如，FokI，TauI）可能會與 DNA 緊密結合，導致電泳時出現明顯的凝膠遷移。使用含 SDS 的上樣染料，加熱使酶從切割的 DNA 上解離開來，均可避免出現這類凝膠遷移現象。

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