雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)的注意事項有哪些？

雙螢光素酶報告基因通常以螢火蟲螢光素酶為報告基因，以海腎螢光素酶為內(nèi)參基因，如此所構(gòu)成的報告系統(tǒng)有檢測靈敏度高、動態(tài)范圍廣、內(nèi)參平衡等優(yōu)勢，因此在實(shí)驗(yàn)中得到廣泛應(yīng)用。那么你知道雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)的注意事項有哪些嗎？讓我們一起來看看吧！

一、熒光值過高

熒光值過高可能會超出儀器檢測范圍，從而檢測不到值，一般讀數(shù)在5-6位之間較好。熒光值過高可通過以下方式嘗試解決：

1.減少質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量；

2.細(xì)胞樣品裂解后，離心取上清后檢測或?qū)α呀猱a(chǎn)物進(jìn)行稀釋后檢測。

（注：不建議通過減少底物量來降低熒光值，需要保證底物的飽和來反映熒光素酶真實(shí)的表達(dá)水平，否則會造成檢測結(jié)果出現(xiàn)大的偏差。）

二、熒光值過低或無熒光值

1. 啟動子活性低

a.優(yōu)化細(xì)胞的培養(yǎng)條件，提高熒光素酶的表達(dá)量；

b.更換強(qiáng)啟動子（如SV40、CMV）。

2. 轉(zhuǎn)染效率低

a.優(yōu)化轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)條件，用較易轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒做陽性對照（如轉(zhuǎn)染過表達(dá)熒光蛋白質(zhì)粒）；

b.確保轉(zhuǎn)染DNA的質(zhì)量，可通過酶切或瓊脂糖凝膠電泳的方法對DNA質(zhì)量進(jìn)行鑒定；

c.選擇活性較高，處于指數(shù)分裂期的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

3. 樣品裂解效率低

a.細(xì)胞培養(yǎng)時間不宜過長，12-36h內(nèi)最好，長時間培養(yǎng)后，細(xì)胞可能會難裂解；

b.加入的裂解液需足量，保證細(xì)胞能夠充分裂解。

4. 熒光信號衰減

熒光素酶的半衰期一般約30min，加完底物后可立即檢測，盡量在30min內(nèi)完成。

5. 底物氧化失效

a.底物避光密封保存，螢火蟲熒光素酶底物-20℃保存；海腎熒光素酶底物推薦-80℃保存；

b. 反應(yīng)工作液建議現(xiàn)用現(xiàn)配。

三、如何判斷轉(zhuǎn)染成功

1. 如轉(zhuǎn)入的miRNA帶熒光標(biāo)記如GFP，則可直接在轉(zhuǎn)染后、細(xì)胞裂解前，顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光；

2. 如轉(zhuǎn)入的miRNA不帶任何熒光標(biāo)記，可考慮進(jìn)行miRNA的qRT-PCR檢測，通過檢測結(jié)果判斷實(shí)驗(yàn)組2、4、6是否相對其對照組miRNA有顯著過表達(dá)；

3.設(shè)置一個熒光質(zhì)粒轉(zhuǎn)染參照組，同批轉(zhuǎn)染一個組的細(xì)胞，間接反映出同批次實(shí)驗(yàn)的轉(zhuǎn)染情況。

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