細(xì)胞傳代培養(yǎng)的常見(jiàn)問(wèn)題有哪些？

細(xì)胞培養(yǎng)是指從體內(nèi)組織取出細(xì)胞在體外模擬體內(nèi)環(huán)境下，在無(wú)菌、適溫和豐富的營(yíng)養(yǎng)條件下，使其生長(zhǎng)繁殖，并維持其結(jié)構(gòu)和功能的一種培養(yǎng)技術(shù)。那么你知道細(xì)胞傳代培養(yǎng)的常見(jiàn)問(wèn)題有哪些嗎？讓我們一起來(lái)看看吧！

一、細(xì)胞何時(shí)進(jìn)行傳代

通常當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至wan全匯合進(jìn)行傳代，避免細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)密，對(duì)于特殊情況，比如有接觸抑制的細(xì)胞，一般在密度70-80%就進(jìn)行傳代，避免引起細(xì)胞分化。

二、貼壁細(xì)胞胰酶消化如何控制時(shí)間

貼壁細(xì)胞培養(yǎng)一個(gè)關(guān)鍵步驟胰酶消化，消化過(guò)度會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞碎片增多，細(xì)胞成片脫落，嚴(yán)重影響細(xì)胞活性，并有部分細(xì)胞漂浮，隨棄去的胰酶流失，消化不足則細(xì)胞難于從瓶壁上吹下，反復(fù)吹打造成細(xì)胞損傷，活性下降。

一般濃度在0.25-0.5%。作用時(shí)間根據(jù)細(xì)胞種類(lèi)、作用溫度等因素而變化很大，從幾分鐘到幾十分鐘不等。0.25%的胰酶作用于單層貼壁的細(xì)胞，在37度條件下，一般消化1-5分鐘就足夠了。終止是用血清。主要對(duì)于新購(gòu)買(mǎi)的細(xì)胞，可以先用低濃度的胰酶去摸索一下消化時(shí)間，可每隔1分鐘鏡下觀察細(xì)胞是否變圓，記錄最佳消化時(shí)間，下一次操作參考之前的記錄來(lái)控制時(shí)間即可。

三、如何看活細(xì)胞

可通過(guò)顯微鏡觀察：活細(xì)胞中間透亮，飽滿，有光澤，死細(xì)胞較暗。或通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色來(lái)計(jì)算細(xì)胞活力，活細(xì)胞排斥臺(tái)盼蘭，因而染成藍(lán)色的細(xì)胞是死細(xì)胞。有細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的，可直接用計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)。

四、細(xì)胞傳幾代開(kāi)始死亡或細(xì)胞存活率不佳，增值變慢

可能是培養(yǎng)基使用錯(cuò)誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳；血清使用錯(cuò)誤或血清的品質(zhì)不佳；或者消化過(guò)度，對(duì)細(xì)胞有嚴(yán)重影響；或者是傳代比例不合適；細(xì)胞存在污染等。

五、細(xì)胞在培養(yǎng)中常出現(xiàn)黑點(diǎn)

首先肉眼觀察培養(yǎng)液是否變渾濁，如果變渾濁，基本可以確定是污染;如果肉眼觀察培養(yǎng)液沒(méi)有變渾濁：在顯微鏡下觀察黑點(diǎn)大小和形狀是否規(guī)則，是否運(yùn)動(dòng)，是做布朗運(yùn)動(dòng)還是呈直線型快速移動(dòng)。如果黑點(diǎn)大小不規(guī)則，做布朗運(yùn)動(dòng)，黑點(diǎn)可能是細(xì)胞碎片(可能是細(xì)胞狀態(tài)不佳或者消化過(guò)度引起的)，也可能是血清反復(fù)凍融產(chǎn)生的蛋白沉淀引起的，也可能是細(xì)胞的代謝產(chǎn)物。如果黑點(diǎn)大小一致，快速移動(dòng)，很可能是細(xì)菌污染。

六、細(xì)胞成團(tuán)的原因

1. 消化時(shí)吹打太用力，消化太久，消化液太強(qiáng)或有毒性等細(xì)胞死亡釋放出DNA，纏繞其他細(xì)胞，形成黏性的細(xì)胞團(tuán)。

2. 細(xì)胞離心速度過(guò)大或時(shí)間太長(zhǎng)。

3. 消化不wan全的時(shí)候，細(xì)胞和細(xì)胞之間的連接沒(méi)有分開(kāi)；消化過(guò)度的時(shí)候，圓形的細(xì)胞容易聚堆，再分開(kāi)很困難！

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